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細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

主要功能：

（1）血管平滑肌細胞的再生能力是原發(fā)血管病變的重要因素。

（2）表達鈣通道及ICAM-1和VCAM-1，參與血管壁的炎癥反應。

（3）與血管的進展和穩(wěn)定有關。

 生理變化：

（1）主動脈硬化。

（2）主動脈瘤

（3）主動脈鈣化。

基本特性：

（1）組織來源于正常大鼠大動脈組織。

（2）鑒定：肌動蛋白，alpha-SMA和Desmin熒光染色。

（3）原代細胞培養(yǎng)末期液氮凍存。

（4）每凍存管細胞數(shù)：>5×105 cells/1ml。

（5）肌動蛋白，alpha-SMA和Desmin熒光染色驗證。

（6）不含有HIV-1、 HBV、HCV、支原體、酵母。

培養(yǎng)步驟：

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察Ⅱ型肺泡上皮細胞|細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細胞懸起，將細胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號21875-091)，90%；胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲存。

二．細胞處理：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

Transformation Buffer-1　DNA乙酸鈉溶液,pH5.2,3M

人多形核白細胞彈蛋白酶(PMN Elastase)ELISA Kit　駱駝β內(nèi)啡肽(β-EP)ELISA Kit

7WML6.0細胞株　Modified isp5 medium with sodium chloride

pGEM-luc　pCMV6-AC-RFP(pCMV6ACRFP)

豬層連蛋白/板層素(LN)ELISA Kit　兔子促黃體(LH)ELISA Kit

氨芐青干粉　人酸成纖維細胞生長因子1(aFGF-1)ELISA Kit

pSUPER.retro.neo+gfp(pSUPERretroneogfp)　電泳二甲苯藍FF溶液

Sodium Cacodylate Buffer（二甲胂酸鈉緩沖液）,0.1M,pH6.8　pPRIME-TET-GFP-FF3(pPRIMETETGFPFF3)(60908-5595)

人成骨生長肽(OGP)ELISA Kit　Humphres反應法血黃素染色試劑盒

Synthrophomonas medium (sulfate free)　大鼠腦腸肽(BGP/GeHRelin)ELISA Kit

pET-16b(pET16b)(60908-2778)y　Fusibacter paucivorans medium

Haloferax sulfurifontis medium

pcDNAⅠ

兔膀胱基質(zhì)成纖維細胞絞股藍皂苷XLIX；絞股藍皂甙XLIX 英文名稱：Gynostemma pentaphyllum saponins gypenosides XLIX XLIX; 規(guī)格：：HPLC≥98% 10mg/支 保存：：-20℃，避光

藥根堿 英文名稱：Jatrorrhizine 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

藥根堿；藥根堿鹽 英文名稱：Jatrorrhizine hydrochloride; jatrorrhizine hydrochloride 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

白屈菜堿 英文名稱：Chelidonine 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

白屈菜紅堿 英文名稱：Chelerythrine 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

白屈菜紅堿、氯化白屈菜赤堿 英文名稱：Chelerythrine chloride hydrochloride, chelerythrine 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

乙氧基白屈菜紅堿 英文名稱：Ethoxychelerythrine 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

湖貝甲素；新貝母堿 英文名稱：Hupehenine; new alkaloids 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

劍麻皂苷元；劍麻皂甙元 英文名稱：Sisal saponins of tigogenin yuan; 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

款冬酮；款冬素,款冬花素 英文名稱：Coltsfoot Tussilago farfara Flos farfarae ketone; Su, Su 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

連翹苷 英文名稱：Phillyrin 規(guī)格：：HPLC≥98% 20mg/支 保存：：-20℃，避光

操作要點：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細胞能盡快通過*易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細胞轉(zhuǎn)移至準備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。

5）將細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi)，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代，細胞活力恢復后才能進行后續(xù)的實驗。