操作要點：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內，再逐步轉移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內完全解凍，使細胞能盡快通過*易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內，將管內細胞轉移至準備好的離心管內，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉移至離心管內。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。

5）將細胞懸液轉移至T25細胞瓶內，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內培養(yǎng)。

6）觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經過2~3次傳代，細胞活力恢復后才能進行后續(xù)的實驗。

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產品名稱：胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑

英文名稱：（ITS-G）100X

貨號：BH-X020042

規(guī)格：10ml

細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

主要功能：

（1）血管平滑肌細胞的再生能力是原發(fā)血管病變的重要因素。

（2）表達鈣通道及ICAM-1和VCAM-1，參與血管壁的炎癥反應。

（3）與血管的進展和穩(wěn)定有關。

 生理變化：

（1）主動脈硬化。

（2）主動脈瘤

（3）主動脈鈣化。

基本特性：

（1）組織來源于正常大鼠大動脈組織。

（2）鑒定：肌動蛋白，alpha-SMA和Desmin熒光染色。

（3）原代細胞培養(yǎng)末期液氮凍存。

（4）每凍存管細胞數：>5×105 cells/1ml。

（5）肌動蛋白，alpha-SMA和Desmin熒光染色驗證。

（6）不含有HIV-1、 HBV、HCV、支原體、酵母。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察Ⅱ型肺泡上皮細胞|細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數換液方式，棄去半數培養(yǎng)基后，將剩余細胞懸起，將細胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號21875-091)，90%；胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配，液氮儲存。

二．細胞處理：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

蛋白胨水（PW）    250(g)

M17瓊脂    100(g)

膽硫乳瓊脂（DHL）    250(g)

凍干血漿    0.5mL/支×10(g)

牛津瓊脂（OXA）基礎    250(g)

葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基    250(g)

大腸桿和大腸群顯色培養(yǎng)基（ECCA）    1000mL/瓶

胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑補體成分5a(C5a)檢測試劑盒(酶聯吸附試驗法)  ELISAKitforComplementComponent5a(C5a)  規(guī)格：48T/96T  進口、國產

血管內皮生長因子121(VEGF121)檢測試劑盒(酶聯吸附試驗法)  ELISAKitforVascularEndothelialGrowthFactor121(VEGF121)  規(guī)格：48T/96T  進口、國產

S100鈣結合蛋白(S100)檢測試劑盒(酶聯吸附試驗法)  ELISAKitforS100CalciumBindingProtein(S100)  規(guī)格：48T/96T  進口、國產

分泌型卷曲相關蛋白1(SFRP1)檢測試劑盒(酶聯吸附試驗法)  ELISAKitforSecretedFrizzledRelatedProtein1(SFRP1)  規(guī)格：48T/96T  進口、國產

轉酮醇酶(TKT)檢測試劑盒(酶聯吸附試驗法)  ELISAKitforTransketolase(TKT)  規(guī)格：48T/96T  進口、國產

微管蛋白β4(TUBβ4)檢測試劑盒(酶聯吸附試驗法)  ELISAKitforTubulinBeta4(TUBb4)  規(guī)格：48T/96T  進口、國產

毒蕈堿型膽堿受體M3(CHRM3)檢測試劑盒(酶聯吸附試驗法)  ELISAKitforCholinergicReceptor,Muscarinic3(CHRM3)  規(guī)格：48T/96T  進口、國產

胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP3)檢測試劑盒(酶聯吸附試驗法)  ELISAKitforInsulinLikeGrowthFactorBindingProtein3(IGFBP3)  規(guī)格：48T/96T  進口、國產

鈣磷蛋白(CAPS)檢測試劑盒(酶聯吸附試驗法)  ELISAKitforCalcyphosine(CAPS)  規(guī)格：48T/96T  進口、國產

紅膜蛋白7.2b(STOM)檢測試劑盒(酶聯吸附試驗法)  ELISAKitforStomatin(STOM)  規(guī)格：48T/96T  進口、國產